Caco-2 cells permeability

Features


Caco-2 permeability assay 는 신약개발 과정에서 합성된 많은 후보물질들(시험물질)의 소장관 흡수율을 효과적으로 예측할 수 있는 실험계입니다.

  • Caco-2 permeability assay는 polarized Caco-2 cell monolayers을 통과하는 시험물질의 flux rate을 측정하고 생성된 데이터를 사용하여 약물의 생체 내 흡수를 예측할 수 있도록 합니다.
  • Caco-2 cell line은 human colon carcinoma에서 유래된 세포로, apical 표면에 많은 microvilli를 가지며 cell 사이에는 tight junction이 형성되어 있습니다.
  • Cell monolayers를 가로지르는 두 방향 Apical to Basolateral (A-B) 과 Basolateral to Apical (B-A)으로 수송을 평가하여 시험물질이 active efflux되는지 여부에 대한 지표인 efflux ratio를 확인할 수 있습니다.

Assay Design


Test Article Concentration

 10, 100 μM (different concentrations available)

Number of Replicates

 3

Cell culture period

 21 days

Incubation Time

 1 hours

Temperature

 37 ℃

Control compounds

 Propranolol (high permeable),
Mannitol (low permeable),
Digoxin (substrate of P-gp)

Analysis Method

 LC-MS/MS quantification

Data Delivery

 - Papp (×10-6cm/s)
- Efflux Ratio (Papp BtoA / Papp AtoB)
- % Recovery


Data


Table 1. Internal criteria of Caco-2 cells permeability study in house data




Batch description SPMED

Acceptance criteria

for Caco-2 cells

TEER value (Ω cm2)

450-500

> 300 1

Mannitol Papp (×10−6 cm/s)

0.7

0.3 - 0.5 1,3 

Propranolol Papp (×10−6 cm/s)

13

10 - 30 2,4

Digoxin efflux ratio

5.0

> 3 2


Q&A


1. Caco-2 permeability assay에 대해 설명해주세요.
Caco-2 cell은 인간 약물흡수를 예측하는 in vitro model로 널리 사용되고 있습니다. Caco-2 cell은 인간의 대장암에서 파생되며, 세포가 배양되면 세포는 자연적으로 분극된 소장세포 monolayer로 분화됩니다. 세포는 insert plates에 seeding되고 이후, 약 20일 동안 confluent monolayer를 형성하게 됩니다. 배양 후 20일에 시험물질을 apical 과 basolateral 측에 1시간 동안 첨가하여 시험물질의 efflux ratio를 확인할 수 있습니다. 투과계수(permeability coefficient, Papp )는 다음 방정식으로 계산됩니다.
                                                                                                 
2. Caco-2 permeability assay의 데이터 해석은 어떻게 하나요?
 

Caco-2 permeability assay 를 통해 얻은 데이터는 다음과 같이 사용됩니다.

① 시험약물의 Papp 값을 통해 투과 순위를 확인할 수 있습니다. Reference 약물인 mannitol(passive paracellular transport) 및 propranolol(passive transcellular transport)과 시험물질을 동시에 스크리닝을 진행하게 됩니다. Mannitol과 propranolol은 각각 human absorption이 0%, 90%로 시험물질의 순위를 정하기 위한 마커로 사용됩니다.

② 데이터는 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여 시험약물의 PK parameter를 예측하는데 사용될 수 있습니다.

③ Caco-2 데이터를 사용하여 Blood brain barrier(BBB) permeability를 예측할 수 있습니다.



3. PAMPA와 Caco-2 permeability assay의 차이점은 무엇입니까?

 

Caco-2 permeability는 PAMPA(parallel artificial membrane permeability assay)보다 in vivo human absorption에 더 가까운 값을 나타내는 것으로 알려져 있습니다. PAMPA는 단순 수동확산의 척도를 나타내는 반면, Caco-2 model은 약물의 능동 흡수(uptake), 유출 (efflux) 또는 paracellular route를 통한 투과 예측을 제공할 수 있습니다. 이러한 두가지 실험법은 흡수정도가 떨어지는 약물에 대한 근본 원인을 확인하는데 유용하게 사용될 수 있습니다.


4. 시험물질의 efflux는 어떻게 측정합니까?

 


양방향(bidirectional) caco-2 permeability assay는 시험물질의 apical to basolateral 과 basolateral to apical 방향으로의 투과도를 측정하기 위해 수행됩니다. 결과는 일반적으로 efflux ratio 즉, Papp(B-A)/Papp(A-B)로 나타낼 수 있습니다. Efflux ratio가 2보다 크면, 시험약물의 efflux가 발생함을 의미합니다. P-gp의 기질로 알려진 digoxin을 control 물질로 사용하여 efflux transporter의 기능 및 발현을 확인하고 있습니다.

5. 세포가 confluent monolayer를 제대로 형성했는지 어떻게 알 수 있습니까?

 


TEER(Transepithelial Electrical Resistance)값을 측정하여 세포사이의 tight-junction 형성을 확인할 수 있습니다. 



6. 회수율(% recovery)은 어떻게 그리고 왜 계산됩니까?

 


회수율 (% recovery)은 투과도 데이터를 해석하는데 유용하게 사용됩니다. 회수율이 매우 낮으면 용해도 불량, plate에 시험약물의 결합 (플라스틱 실험제품과의 non-specific binding 이슈), Caco-2 세포에 의한 대사, 또는 세포 monolayer에 시험물질의 축적 등의 문제가 있음을 나타낼 수 있습니다.


                               




References


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